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        6XHis標簽的特點以及它的使用方法
        瀏覽次數:16發布日期:2021-09-18
             

        6xHis 標簽,也稱為多組氨酸標簽, His6標簽或hexa組氨酸標簽, 是一種在轉染的細胞中目標蛋白的C端或N端上由至少6個組氨酸殘基鏈接上所組

        成的氨基酸序列。這種標簽通常在重組蛋白的純化中使用,這是因為組氨酸殘基的序列可以在特定的緩沖液條件下結合到幾種類型固定的離子上

        (比如鎳,鈷和銅)從而達到容易檢測和純化His標簽蛋白的目的。

        由于它的相對小的分子量,低的免疫原性,親水性和在去污劑和其他添加劑存在的情況下的易變性, 因此在天然和變性的條件下,多組氨酸標簽是

        被公認為最廣泛使用的親和標簽用于一系列的蛋白純化目的。

        除此之外,它可以檢測和純化重組蛋白而無需使用蛋白特異性的抗體或探針,同時抗His標簽抗體的存在用于His標簽蛋白的檢測中使 6xHis 標簽更

        加的普遍和受歡迎。     


        親和純化蛋白:

        在大腸桿菌和其他原核系統中表達的多組氨酸標簽重組蛋白通常使用固定的金屬離子親和色譜來純化或稱為IMAC.  在這個過程中,支撐物 (通常是

        珠狀瓊脂糖凝膠或磁珠顆粒)用合適的耦合試劑來進行衍生,比如氨三乙酸nitrilotriacetic acid (NTA) 或亞氨乙酸iminodiacetic acid (IDA).

        這些螯合的基團會固定所需要的二價金屬離子 (比如鎳,銅,鈷和鋅),從而這些金屬離子最后負責結合和分離混合液蛋白中的目標分子。在選擇使

        用哪個配基上,你需要考慮IMAC樹脂的結合能力主要取決于被純化蛋白的性質和在純化過程中所使用的金屬離子。

        鎳,鈷,銅是進行純化His標簽蛋白首選的被廣泛使用的離子,由于他們在水溶液中對于組氨酸和半胱氨酸良好的親和性。在這三個離子中,鎳是

        最廣泛使用的金屬離子,它呈現出最高的親和性和選擇性對于His標簽蛋白. 然而,它也會非特異性的結合包含組氨酸群的內源蛋白。

        從另一個側面講,鈷提供最特異性的結合和組氨酸標簽因此當純度是首要選擇時鈷是二價陽離子的首選。

        銅離子和鎳鈷離子相比和His標簽蛋白的結合非常強勁,但是它的特異性在三種離子中是最弱的。由于這個原因,當純度不是最主要的目的時銅離

        IMAC被使用。


        IMAC 方法:

        在制備樣品時,細胞被捕獲和裂解通過酶法或機械條件。因為多組氨酸標簽在生理PH值和離子強度下很好的結合到IMAC樹脂上。結合在幾乎中性

        緩沖液的條件下完成。大部分科研人員使用包含10-25 mM咪唑的TBS溶液作為結合/漂洗緩沖液來防止帶有組氨酸殘基內源蛋白的非特異性的結合.

          被捕獲的組氨酸標簽蛋白的洗脫和回復通常使用增加的咪唑濃度(至少 200 mM)來實現,低PH值或一個過量的強螯合劑比如EDTA.

        你可以從各種起始緩沖液中來純化樣品,因為高濃度的鹽和某些變性劑是兼容的。然后,請記住還原劑,氧化劑和螯合劑比如EDTA通常和IMAC

        和樹脂是不兼容的。


        其他用于His標簽蛋白的應用:

        除了純化多組氨酸標簽重組蛋白之外,6xHis標簽也可以用于如下應用。


        ELISA 或免疫印跡檢測:

        你可以使用鎳螯合的辣根過氧化物酶來進行基于HRP組氨酸標簽蛋白的檢測而無需使用抗體。同時,抗6xHis的抗體是高度靈敏和特異性的對于那些

        含有組氨酸標簽的蛋白.


        蛋白相互作用pull-down:

        鎳瓊脂糖樹脂可以用于純化,鑒定和檢測組氨酸標簽蛋白的相互作用。

        微孔板包被. 鎳或銅包被的微孔板可以從初始樣本或半純化的樣品中使融合蛋白進行包被,從而進行基于各種微孔板和報告基因的檢測.

        凝膠染色. 幾種免疫分析方法利用多組氨酸標簽通過抗多組氨酸標簽抗體或通過SDS-PAGE來檢測靶蛋白.

        熒光標簽. 熒光6組氨酸標簽也被科研人員開發用于蛋白遷移和轉移。   

        滬公網安備 31011202012699號

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