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        細胞轉染實驗質量控制貼士
        瀏覽次數:4發布日期:2021-12-03
             

        細胞轉染技術是指將外源分子如DNA,RNA等導入真核細胞的技術。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發展,轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具。在研究基因功能、調控基因表達、突變分析和蛋白質生產等生物學試驗中,其應用越來越廣泛。影響轉染效率的因素有很多,細胞株本身的特性和活性,細胞培養條件,轉染的DNA或RNA的質量,轉染方法,轉染試劑的選擇等。
        轉染效率受多種因素影響,主要因素有下面幾個:
        1.轉染試劑
        不同細胞系轉染效率通常不同,但細胞系的選擇通常是根據實驗的需要,因此在轉染實驗前應根據實驗要求和細胞特性選擇適合的轉染試劑。當然,最適合的是高效、低毒、方便、廉價的轉染試劑。
        2.細胞狀態
        一般低的細胞代數(<50)能確?;蛐筒蛔?。最適合轉染的細胞是經過幾次傳代后達到指數生長期的細胞,細胞生長旺盛,最容易轉染。細胞培養在實驗室中保存數月和數年后會經歷突變,總染色體重組或基因調控變化等而演化。
        3.轉染方法
        轉染時應跟據具體轉染試劑推薦的方法,但也要注意,因不同實驗室培養的細胞性質不同,質粒定量差異,操作手法上的差異等,其轉染效果可能不同,應根據實驗室的具體條件來確定最佳轉染條件。
        (1)細胞培養物
        不同細胞有不同的培養基,血清和添加物。高的轉染效率需要一定的細胞密度,一般的轉染試劑都會有專門的說明。推薦在轉染前24小時分細胞,這將提供正常細胞代謝,增加對外源DNA攝入的可能。一定要避免細菌,支原體或真菌的污染。
        (2)細胞密度
        不同的轉染試劑,要求轉染時的最適細胞密度各不相同,即使同一種試劑,也會因不同的細胞類型或應用而異。因此如果選用新的細胞系或者新的轉染試劑,最好能夠進行優化實驗并為以后的實驗建立一個穩定方法,包括適當的接種量和培養時間等等。陽離子脂質體具有微量的細胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細胞數,有的要求細胞90%匯片;而有些多胺或者非脂質體的配方則要求在40%-80%之間,總之是盡導致和轉染相關的細胞行為的變化。
        (3)血清
        轉染產品配方幾經革新后的今天,對于主流的轉染試劑來說,血清的存在已經不會影響轉染效率,甚至還有助于提高轉染效率,如陽離子聚合物等,血清的存在會影響DNA一轉染復合物的形成,但只要在DNA-轉染復合物形成時用無血清培養基或PBS來稀釋DNA和轉染試劑就可以了,在轉染過程中是可以使用血清的。不過要特別注意:對于RNA轉染,如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關注的。胎牛血清(FCS)經常用到,便宜一點的有馬或牛血清。
        (4)抗生素
        目前轉染試劑因為全程都可以用有血清和抗生素等添加劑的完全培養基來操作,非常方便,省去了污染等麻煩。
        (5)氮磷(N/P)比
        N/P比是轉染效率的關鍵(為了換算方便,一般以DNA/轉染試劑質量比表示),在一定比例范圍內轉染效率隨N/P比成比例增高,之后達到平值,但毒性也隨之而增加,因此在實驗之前應根據推薦比例,確定本實驗的最佳轉染比例。
        (6)DNA質量
        DNA質量對轉染效率影響非常大。一般的轉染技術(如脂質體等)基于電荷吸引原理,如果DNA不純,如帶少量的鹽離子,蛋白,代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成及轉染的進行。
        4.載體構建
        轉染載體的構建(病毒載體,質粒.DNA,RNA,PCR產物,寡核苷酸等)也影響轉染結果。病毒載體對特定宿主細胞感染效率較高,但不同病毒載體有其特定的宿主,有的還要求特定的細胞周期,如逆轉錄病毒需侵染分裂期的宿主細胞,此外還需考慮一些安全問題(如基因污染)。除載體構建外,載體的形態及大小對轉染效率也有不同的影響,如前面提到的超螺旋及線性DNA對瞬時和穩定轉染的影響。如果基因產物對細胞有毒性作用,轉染也很難進行,因此選擇組成或可調控,強度合適的啟動子也很重要,同時做空載體及其它基因的相同載體構建的轉染正對照可排除毒性影響的干擾。

        滬公網安備 31011202012699號

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