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        各種蛋白純化分離大集合(一)!
        瀏覽次數:5發布日期:2022-02-28
             

        蛋白純化的目的是將目標蛋白質從細胞裂解液的全部組分中分離出來,同時仍保留蛋白的生物學活性及化學完整性。蛋白質的分離和提純工作是一項艱巨而繁重的任務,需根據蛋白的特性選擇合適的純化方法來提高獲得的蛋白制品的純度。


        一、沉淀法

        01鹽析:

        實驗原理:中和蛋白質表面電荷并破壞水化膜。

          蛋白質易溶于水,因為其分子的-COOH -NH2和-OH都是親水基團,這些基團與極性水分子相互作用形成水化層,包圍于蛋白質分子周圍形成1~100 nm大小的親水膠體,從而削弱了蛋白質分子之間的作用力。當大量鹽加到蛋白質溶液中,高濃度的鹽離子(如硫酸銨的 SO42- 和NH4+)有很強的水化力,可奪取蛋白質分子的水化層,使之"失水",于是蛋白質膠粒凝結并沉淀析出

        02等電點沉淀法:

        實驗原理:利用蛋白質在等電點時溶解度最低而各種蛋白質又具有不同等電點的特點進行分離的方法。

          在等電點時,蛋白質分子以兩性離子形式存在,其分子凈電荷為零(即正負電荷相等),此時蛋白質分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥,分子相互之間的作用力減弱,其顆粒極易碰撞、凝聚而產生沉淀,所以蛋白質在等電點時,其溶解度最小,最易形成沉淀物。

           注意點:不同的蛋白質,具有不同的等電點。同一種蛋白質在不同條件下,等電點不同。

        03有機溶劑沉淀法:

        實驗原理:加入有機溶劑使水溶液的介電常數降低,因而增加了兩個相反電荷基團之間的吸引力,促進了蛋白質分子的聚集和沉淀。

            有機溶劑引起蛋白質沉淀的另一種解釋認為與鹽析相似,有機溶劑與蛋白質爭奪水化水,致使蛋白質脫除水化膜,而易于聚集形成沉淀。

            影響因素:(一)有機溶劑的選擇 (二)溫度的控制 (三)pH值 (四)離子強度

            用此法析出的沉淀一般比鹽析法易過濾或離心沉降,分離后的蛋白質沉淀應立即用水或者緩沖液溶解,以達到降低有機溶劑的濃度的目的。此法在血液制品的制備過程中較多使用。


        二、層析

        01離子交換柱層析:

        實驗原理:以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。是發展最早的層析技術之一,目前已成為蛋白質分離純化最常用的手段,是基于蛋白質電荷不同的分離技術。

        離子交換層析中,基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂;而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,所以這類蛋白質被留在柱子上,然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施,將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。

        02疏水相互作用層析:

        實驗原理:根據分子表面疏水性差別來分離蛋白質和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。

            蛋白質和多肽等生物大分子的表面常常暴露著一些疏水性基團,我們把這些疏水性基團稱為疏水補丁,疏水補丁可以與疏水性層析介質發生疏水性相互作用而結合。不同的分子由于疏水性不同,它們與疏水性層析介質之間的疏水性作用力強弱不同,疏水作用層析就是依據這一原理分離純化蛋白質和多肽等生物大分子的。

        03親和層析:

        實驗原理:利用蛋白質能和某些專一分子可逆結合的特性,

            當蛋白質溶液通過層析柱時,其中可與親和載體配基相互作用的受體被吸附劑結合,不被吸附的無關成分則可隨流出液通過柱體,從而將吸附蛋白與其他蛋白質分開。此法特異性強,收率高。

        04凝膠層析:

        實驗原理:根據分子大小分離蛋白混合物的最有效的方法之一?;旌衔镫S流動相流經裝有凝膠固定相的層析柱時,其中各物質因分子大小的的不同而被分離的技術。